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Mario e Luigi, i gemelli idraulici, applicano il loro motto "Let's-a-go" per risolvere i problemi di ogni giorno nella loro nuova casa del Regno dei Funghi. Mentre sono impegnati ad aiutare la Principessa Peach e a riportare sulla retta via Bowser, rimpicciolito e imprigionato, incontrano un nuovo compagno: Yoshi. La festa di compleanno della Principessa Peach dà luogo a un'avventura galattica, che vede i due fratelli lanciarsi nello spazio per fermare i loschi piani di Bowser Jr. e salvare la principessa Rosalinda.